Levofloxacin wirkt bakterizid. Wie andere Fluorchinolone hemmt es das Enzym Gyrase, welches für DNA-Supercoiling in Bakterien während deren Vermehrungszyklus verantwortlich ist. Die Wirksamkeit gegenüber Haemophilus influenzae und Moraxella catarrhalis ist wie bei allen Chinolonen sehr gut. Auch Chlamydien sind empfindlich gegenüber Levofloxacin.